光绪的病情突然转危，不久死去。名医屈桂庭在《诊治光绪帝秘记》记载光绪死前三天“在床上乱滚”，“向我大叫肚子痛得了不得”，且“面黑，舌焦黄”，“此系与前病绝少关系”。而光绪入殓也一反常规地由宫内太监办理，讳莫如深。据说是慈禧令太监将他毒死的。
有的学者认为，由于袁世凯的叛卖告密，使慈禧镇压了维新运动。袁世凯担心慈禧死后光绪重新执政，将会问罪于他，于是就与庆亲王勾结，打算废黜光绪，立庆亲王之子为帝，事不成，就下手毒杀了光绪。在2008年，经过对光绪皇帝残留的一缕头发的鉴定，证实死于砒霜中毒。
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